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人精子荧光原位杂交技术与男性不育
『信息来源：维普资讯 』 『打印本文』 『 2008-04-21 』 |
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研究人类精子染色体非整倍体是当今生殖医学领域的又一热点。早在1978年人们就用去透明带的仓鼠卵做精子穿透试验，进行精子非整倍体的研究，此项研究方法学复杂，不适合大样本量研究。近十年来应用荧光原位杂交(FISH)技术可以对成千上万条精子进行检测，大大促进了精子非整倍体的研究。这项技术已用于许多男性不育的非整倍体率的研究。最初的研究使用单色探针，其缺陷是不能区分精子染色体二体和二倍体。双色FISH就可鉴别二体和二倍体精子，近来的研究采用多色FISH，同时对精子的多条染色体进行非整倍体的研究，能够更全面地了解非整倍体率与男性不育的关系。
人精子F1SH技术
精子FISH技术包括:精液的前期处理、精子核去浓缩、荧光原位杂交、精子染色体分析。
一、精子的前期处理
1.精液分析不同方法获得的精子均按世界卫生组织(WHO)规定精液常规分析标准进行精液分析。
2.精液洗涤取精液标本用两倍于精液的PBS缓冲液洗涤2次，6mM EDT'A/0. 1MPBS液体2m1将沉淀团吹打均匀，300g离心
3.精子的固定精子团中加人2m1固定液，300g离心lumin，反复2次，最后精子团用固定液调浓度至20 x 106/ml,取一滴在玻片上方滴下，使精子均匀分布于玻片。风干，立即进行去凝集，或在一20℃保存待以后分析。
4.丸活检精子的处理X27活检到的皋丸组织放到培养液中，置解剖镜下，用TB注射针头分离、撕碎精曲小管，然后用吸管反复吹打，静置一段时间，让活动精子自精曲小管游出;去除大块组织，将混悬液300g离心lumin，取沉渣，在倒置显微镜下寻找成熟精子，用显微注射针吸取成熟的辜丸精子，在培养液中反复清洗去掉杂质，将精子移人洁净载玻片的PBS小微滴上，风干并用钻石笔标记。把风干的玻片放冰固定液固定，取出后风干。立即进行去凝集。或在一20℃保存待以后分析。
二、精子核去凝集
由于精子头染色体高度浓缩，增加了精子细胞遗传学研究的难度，精子核去凝集就是打破精子核内鱼精蛋白的二硫化合物桥，并使精子核肿胀，增加探针的穿透性，提高杂交率。常用方法有两种。
1.方法一：(1)FISH前自一20℃取出玻片，在2 x SSC中洗片; (2) 玻片在含30mM DTT的0. 1 M Tri。缓冲液(pH8. 0 )中，温浸泡1h;(3) 玻片在含25mM二碘水杨酸锉(LIS) /IOmMDTT的0. 1 M Tri，缓冲液(pH8. 0 )中，室温浸泡3h。观察精子的肿胀情况，直至精子头部体积是原来的2倍，而且精子头呈圆形、饱满;④在2 x SSC中洗片。风干。
2.方法二：FISH前自一20℃取出玻片，在2 x SSC中洗片。玻片在装有5 mM DTT/1 % Triton X一100的染色缸内浸泡30一60min，观察精子的肿胀情况，直至精子头部体积是原来的2倍，而且精子头呈圆形、饱满。在2 x SSC中洗片。风干。
三、精子荧光原位杂交
1.脱水取去凝集后的玻片用钻石笔在背面划一个直径0. 5cm小圆圈，标记杂交位置;依次放70%,85%,100%酒精脱水5min，置60`C烘箱60min;烘干后的玻片再次系列酒精脱水，风干。
2.变性玻片放70%甲酞胺73% ,3 -5min变性。然后依次放70%,85%,100%冰酒精脱水。
3.杂交自一20℃冰箱取出探针，解冻后离心混匀，取探针液10闪加在圆圈位置，加盖玻片，注意避免有气泡产生，以免影响杂交效果，用封口膜将盖玻片封口。放湿盒37℃杂交4一24h。湿盒内加少量2 x SSC，保持温度。
4.洗脱去除封口膜及盖玻片，玻片放0. 4 x SSC/0. 3 %NP40洗液73'C ,2min;再放2 x SSC/0. 1 % NP40洗液，室温，I min。洗脱非特异性杂交。
5.复染在加探针液位置加DAPI 10闪，使背景染色。
四、精子染色体分析
荧光显微镜下观察荧光信号。所有标本的杂交率必须在95%以上，在可能的情况下每位患者的每张杂交片至少计数2 000条精子，以利于统计学分析。计数荧光信号时注意:①精子头部核膜完整，边缘清晰;核内荧光信号清晰可见，大小、强弱基本相同，两信号间距至少有一个信号的距离，位置清楚地存在于精子头内;②如两个信号非常接近，互相有交叉或两者之间距离小于信号大小的一半时，判断为一个信号;③重叠的精子不计数;④过度去凝集的精子变得异常大，荧光信号有可能会太大、强度减弱、有分裂，不宜分辨，不计数;⑤由于缺对染色体和杂交失败很难区分，所以缺对染色体不计数，缺对染色体率以同一条染色体的二体率为准。
正常人群精子非整倍体率
对于正常男性精子非整倍体发生率有许多研究报道，但不同的实验室对精子同一条染色体二体率的报道差异很大，这此差异很可能是由个体差异造成，但技术方面如精子去浓缩方法，观察精子数，评价标准，应用不同的探针等可能也是影响结果的重要因素。因此加强实验室间的质量控制，提高操作人员的技术水平十分重要。根据目前报道的数据，保守的估计正常男性精子平均常染色体二体率约为0.13%，性染色体二体率为0.37%，男性精子异倍率至少为6.5% 。此外正常男性精子二倍体率为0.2%(0.06%一0.24%)，就目前的研究资料显示精子染色体二体率高于流行病学研究发现的父源性子代三体的发生率川，因此精子非整倍体率与父源性子代非整倍体率的相关性还需要进一步探讨。
精液指标与精子非整倍体率
染色体核型正常的少弱畸精症患者精子非整倍体率升高，一般认为与生殖细胞系的染色体联会异常有关，减数分裂失调与精液质量呈线性关系。多项研究显示精子非整倍体率和精液常规(密度、活率、畸形率)呈负相关。Bernardi-ni研究结果显示，当活动精子计数<5 x 106/ml时，X,Y及17号精子染色体二体、二倍体率较对照组升高两倍(2.34%比1.38%)。很多研究表明严重少精症患者精子表现最多的是性染色体二体率升高，说明性染色体更易发生不分离导致减数分裂错误。Schmid等认为少精症患者不仅精子XY异倍体率及XY二倍体率明显升高，而且精子染色体失调率和精子染色体DNA线性断裂率也明显升高，说明少精症患者存在不同水平的遗传缺陷。
精子形态和活力与精子非整倍体率的相关性争论最多。Lewis一nes等认为精子染色体异常与精子畸形有关，他们对3例外周血染色体核型正常的少弱畸精症患者(畸形率100%，为双头畸形、大头畸形和多尾畸形)，用X, Y,18三色探针进行精子FISH，发现精子二体率、三体率、四体率分别为100%,76%,82.5%. Devillard[15]等对大头畸形精子的研究有相同的结论。对这类患者应用助孕技术治疗(IVF/ICSI)要慎重。Rives等研究发现，非整倍体率与精子的活力和形态无关，而与精子密度有关。Vegetti等认为精子非整倍体率与形态无关，而与精子总前向活动率呈负相关。有几种因素可能导致这些矛盾的结果:其一，研究中应用的形态学标准不同(WHO/Kruger' s )。其二，有可能精子非整倍体率与某种特殊类型的形态异常有关，如双头、大头、多尾等。其三，将弱精和/或畸精作为一个单独指标有困难，因为很少有患者存在单一的精子损害，大多数弱精和/或畸精同时也是少精症。
男性不育与精子非整倍体率
不育男性常伴有严重精子形态学异常，这与生殖系统中精子遗传学损害及精液中生殖细胞数少有关。对于男性不育患者精子非整倍体率的报道不一致，并且数据有争议。有研究认为生育组和不育组的非整倍体率没有差异，也有报道不育男性精子非整倍体率上升。可能与男性不育类型有关，如:少精症、弱精症、少弱精症、少畸精症、弱畸精症、少弱畸精症、不明原因不育、免疫性不育等;男性不育病因不同导致不同的精子FISH结果，因此需要更大数量的病例研究。目前较一致·510·的结论是极度少精症(< 5 x 106/ml)患者精子异倍体率明显升高，尤其是性染色体的异倍体率升高。 卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)为男性因素引起的不育治疗带来革命性突破，成为严重少精子症、阻塞无精子症和一些非阻精子症的首选治疗方法;由于该技术在应用于人类前缺乏足够的动物实验和临床资料验证其安全性，随意选择一条精子注入卵浆，跨越了人类的生殖过程中有效的生物学筛选，有可能将携带染色体畸变、缺失或基因突变的精子注人卵胞浆内，使卵子受精，从而将男性不育的遗传缺陷传递给后代，因此该技术有可能增加了将遗传异常传递给后代的危险性。Van Steirteghem追踪ICSI后出生的9781个孩子，分析后认为在主要先天性畸形的发生率与自然受孕出生孩子相比无明显上升，但性染色体非整倍体率和常染色体结构异常率明显升高(0.6%比0.2%,0.4%比0.07%)。这些染色体异常有可能是父源性的，提示某些与男性不育有关的遗传缺陷可能传递给后代。BurrelIoi2ol等研究结果显示精子非整倍体率升高的ICSI患者与精子非整倍体率正常的ICSI患者比较其受精率、卵裂率正常，但妊娠率、种植率低，而流产率高。胚胎学家显微操作时通常会选择形态正常、活力好的精子做ICSI，但研究证实上游法处理的精子中仍有非整倍体精子，而Ryui227认为精子畸形率>%%的不育男性中正常形态精子的非整倍体率比对照组高2一3倍，因此形态正常的精子也存在染色体异常现象。提示非整倍体精子可能影响胚胎早期发育，影响胚胎种植，导致流产。严重少精症男性精子XY二体危险性较大，主要是由于第一次减数分裂不分离造成的。如果用其非整倍体精子进行ICSI，后代就有可能发生非整倍体染色体异常。如47, XXY胎儿;因此需要对患者进行精子FISH的研究和胚胎种植前遗传学诊断，筛查非整倍体，以便更好地对需要ICSI治疗的夫妇进行遗传学咨询。
越来越多的数据显示男性不育与精子非整倍体率存在潜在的相关性。精子染色体非整倍体与自然流产、胎儿畸形有关。Rubio等认为ICSI后自然流产和反复种植失败者是精子染色体异常的高危人群，这类男性患者精子性染色体二倍体率较正常对照组明显升高。ICSI后反复种植失败者的胚胎质量差与精子质量有关，精子的非整倍体性严重影响胚胎染色体结构，卵子有可能被染色体结构异常的精子受精导致种植失败。
性染色体数目异常不育男性的精子非整倍体率
应用FISH技术研究性染色体异常男性患者精子非整倍体率显示Klinefelter综合征和47 , XYY核型男性表现为精子性染色体超倍体率和二倍体率升高t24,-1，这种异常升高是由于生殖细胞系正常生精细胞受皋丸内不良环境(如LH和FSr311升高)影响，使生精细胞在减数分裂过程中发生染色体不分离造成的。而不是由染色体异常的XXY/XYY细胞生成。Blanco'2"等研究结果也证实了这一结论，他们发现在2例Klmefelter综合征患者减数分裂前期皋丸组织中存在大量的染色体异常细(88.5% , 28.3%)，但进入减数分裂粗线期时生精细胞全部为XY细胞，说明染色体异常细胞在进人减数分裂前发育阻滞，但精子中却存在较多性染色体二体(18.3%,1.7%)。在另一例XYY病例中发现肇丸组织减数分裂前生精细胞染色体多为XYY(95.9% )，进人粗线期后下降为57.9%，而精子中仅有0.11%是性染色体二体，说明染色体异常的生精细胞在发育过程中的各个时期均存在发育阻滞现象。由于染色体异常生殖细胞在发育过程中的阻滞，使得这些患者的精子异倍体率比预计的低。
FISH技术用于研究精子染色体结构，方法简单，适合对大量人精子进行非整倍体的研究。男性不育与精子染色体异常存在潜在相关性，对精液异常的男性不育患者治疗前进行精子非整倍体分析，有助于优生和遗传咨询。 |
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