电泳技术介绍
一．概念
带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳（Electrophoresis）。带正电荷的粒子向负极方向移动，带正电荷的粒子向负极方向移动，带负电荷的粒子向正极方向移动。
电泳技术是生物化学与分子生物学中重要的研究方法之一，利用电泳技术可分离许多生物物质，包括氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸以及核酸等，并可用于分析物质的纯度和分子量的测定等。
二．原理
许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动。由于混和物中各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，即使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。
1.迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度
在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝QE
质点的前移同样要受到阻力（ f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f ＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度）
当质点在电场中作稳定运动时：F＝ f 即：QX＝6πrην
所以 v=QE /6πrη
迁移率u：单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。
μ＝v/E=Q/6πrη
由上式可知，带电颗粒的迁移率在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的数量、颗粒大小、形状和介质的黏度等多种因素有关，一般说：所带的净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球型，则在电场中泳动速度愈快；反之则慢。
两种不同的粒子一般有不同的迁移率，具体实验中，移动速度v为单位时间t内移动的距离d
∴ v＝d/t
电场强度E为单位距离内电势差U，l为支持物的有效长度，
∴ E＝U/l
∴ μ=v/E=dl/Ut
v为粒子的泳动速度（cm/s或min），E为电场强度或电势梯度（V/cm），d为粒子泳动距离（cm），l为支持物的有效长度（cm），U为加在支持物两端的实际电压（V），t为通电时间（s或min）。故迁移率（或泳动度）的单位为cm2·s－1·V－1。
某物质（A）在电场中移动的距离为：
dA＝μA×（Ut/l）
另物质（B）的移动距离为：
dB＝μB×（Ut/l）
两物质移动距离差为：
d＝dA-dB＝（μA－μB）×（Ut/l）
∴物质A,B能否分离决定于两者的迁移率，若它们的迁移率相同则不能分离，有差别才能分离，差别越大，分离越好。
三．影响电泳的因素
1．电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。
常压电泳：2－10V/cm
根据电场强度的大小
高压电泳：20－200V/cm
电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应使蛋白质变性，必须有散热措施，才能得到好的效果。
2．溶液的pH值
溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。对于两性电解质，介质的pH值离等电点越远，所带净电荷越多，则泳动速度越快，反之则慢，若在等电点pH介质中则不能移动。
3．缓冲液的离子强度
缓冲液的离子强度低，电泳速度快，但分离区带不清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如果离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，难维持pH值的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量使电泳速度过慢。所以最适离子强度一般为0.02-0.2mol/L之间。
4．电渗现象
液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗。
若原带电物质向负极移动，则移动更快；原带电物质向正极移动，则移动减慢，实际泳动速度是本身速度和电渗作用之和，故应选择电渗作用小或无电渗作用的材料为好
四．电泳的分类
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电泳 |
显微电泳 |
自由界面电泳 |
区带电泳又称区域电泳，即电泳在不同的惰性支持物中进行，使各组分成带状区间。 |
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区带电泳 |
滤纸及其他纤维素薄膜电泳 |
eg：纸电泳醋酸纤维素薄膜电泳 |
支持物凝胶电泳 |
eg：琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
物理性粉末电泳 |
eg：纤维素、淀粉、琼脂粉等 |
状分类线丝电泳 |
eg：尼龙丝、人造丝电泳，是一类微量电泳 |
支持物平板式电泳 |
电泳支持物（如凝胶）制成水平板状 |
装置形垂直板式电泳 |
板式支持物，垂直方向电泳 |
式分类连续电泳 |
首先应用于纸电泳，主要用途是制备一定量的电泳纯物质 |
圆盘电泳 |
电泳支持物过于玻璃管中，电泳区带成圆盘状 |
按pH的连续pH电泳 |
电泳的全部过程中缓冲液的pH值保持不变，纸电泳 |
连续性非连续pH电泳 |
缓冲液和支持物间有不同的pH值，SDS-PAGE、等 |
分类 |
电聚焦电泳，等速电泳等 |
五．几种常用电泳
1．醋酸纤维素薄膜电泳
以醋酸纤维素薄膜为支持物
醋酸纤维素薄膜是一种细密而薄的微孔膜。
特点：
（1）电泳后区带界限清晰；
（2）通电时间较短；
（3）它对各种蛋白质几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；
（4）灵敏度高，样品用量少。
（5）对染料也没有吸附。
2．琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，由D-半乳糖和3，6－脱水－L半乳糖连接而成的一种线性多糖。它具有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
优点：
- 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳
- 琼脂糖凝胶结构均匀，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好
- 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量测定
- 电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。
琼脂糖凝胶电泳主要用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。
3．聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。它是由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成，这一聚合通常需要有自由基催化完成。
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等
（1）优点
①几乎无电渗作用。
②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度变化较稳定。
③在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。
④凝胶孔径可调。
⑤分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。
（2）聚丙烯酰胺凝胶的制备
聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，Acr和Bis无论单独存在或混合在一起时都是稳定的，出现自由基团时，就会发生聚合反应，自由基团的引发有化学和光学两种方法，通常我们使用化学聚合，如催化系统：过硫酸铵――TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸铵产生游离氧原子，使单体成为具有游离基状态，从而发生聚合，TEMED的作用是加速剂。分子氧阻止聚合，冷却也可使聚合速度变慢，对这些因素加以控制，聚合一般在1h内完成。
（3）聚丙烯酰胺凝胶孔径的调节
凝胶孔径、机械性能（弹性）、透明度等在很大程度上取决于Acr和Bis二者的总浓度T％。T％越大，孔径越小，机械强度则增加。凝胶的特性是分子筛效应。在聚合前调节单体的浓度来控制凝胶孔径大小，根据分离样品分子大小制备不同孔径的凝胶。
（4）分离蛋白的基本原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；不连续系统中由于缓冲液离子成分、带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此具有很高的分辨率。
4．SDS-PAGE
主要用于测定单链蛋白质或者蛋白质分子的亚基相对分子质量，是目前测定亚基相对分子质量的一种较好方法。它可用于多肽分子质量分析，变性蛋白质分离。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成SDS蛋白质复合物。由于SDS带负电荷，使各种SDS－蛋白质复合物都带上相同密度负电荷，它的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS－蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质的相对分子质量有关。在一定条件下，迁移率与蛋白质的相对分子质量的对数成正比。
在测定蛋白质相对分子质量时，通常选用已知相对分子质量的标准蛋白质为标记物，与未知相对分子质量的待测蛋白质在同一块胶上进行SDS-PAGE，用标准蛋白质的相对迁移率与相对分子质量的对数作图，根据未知蛋白质的相对迁移率即可在标准曲线上求得其相对分子质量。
SDS-PAGE是在电泳样品中加入含有SDS和β－巯基乙醇的样品处理液，SDS可断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级、三级结构，强还原剂β－巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品中加入样品液后，要在沸水浴中煮3－5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。
5．等电聚焦电泳
不同物质由于带电性质不同，因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同,可以进行分离。蛋白质具有许多可解离的酸性基团（－COOH）和碱性基团（－NH2）及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
6．二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
双向凝胶电泳技术(2DE)：又称二维电泳，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。完整的双向凝胶电泳分析，包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS—PAGE、斑点染色、图像捕捉和图谱分析等步骤。 |
